用單個(gè)錐形光纖植入物進(jìn)行深度分辨光纖光度測(cè)定

（轉(zhuǎn)譯自文獻(xiàn)Depth-resolved fiber photometry with a single  tapered optical fiber implant）

活體熒光檢測(cè)可用于記錄和研究自由運(yùn)動(dòng)動(dòng)物腦深部遺傳定義的神經(jīng)群的功能信號(hào)。例如，纖維光度法通過監(jiān)測(cè)特定細(xì)胞類型神經(jīng)活動(dòng)時(shí)熒光隨時(shí)間變化來實(shí)現(xiàn)。這些方法推動(dòng)了基于光子學(xué)和光電子平臺(tái)技術(shù)以及使用多路復(fù)用技術(shù)記錄多個(gè)亞種群活動(dòng)方法的發(fā)展。通常情況下，光纖測(cè)量方案依賴于扁平切割光纖進(jìn)行刺激和收集熒光2-9,11 - 19。

然而，由于組織散射和吸收效應(yīng)，扁平切割光纖的可訪問記錄深度僅限于光纖jian 端附近，這與探針的幾何形狀相結(jié)合，決定了熒光激發(fā)和收集效率20,21。簡(jiǎn)單的幾何計(jì)算表明，扁平切割光纖收集的信號(hào)量隨著與光纖面距離的增加而急劇減少。此外，重新配置收集幾何形狀以達(dá)到多個(gè)區(qū)域是不可能的，因?yàn)楦淖児馐占瘓?chǎng)需要重新定位光纖。此外，扁平切割光纖的幾何形狀嚴(yán)重?fù)p害組織，在大腦中，甚至在植入后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，也會(huì)誘導(dǎo)裝置周圍的神經(jīng)膠質(zhì)激活22,23。盡管如此，平劈光纖被廣泛用于評(píng)估腦深部區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)3,11-19。

在這里，我們提出了一種克服這些限制的方法:我們利用TF中光傳播的模態(tài)特性在錐度的大光學(xué)活性區(qū)域上構(gòu)造光收集模式并進(jìn)入更深的細(xì)胞。除了比扁平切割光纖22具有更小的侵入性外，TF探針還具有du 特的光收集特征，包括:(i)沿光纖軸在高達(dá)2mm的組織上具有均勻的界面，(ii)通過分時(shí)多路復(fù)用沿錐度進(jìn)行多點(diǎn)收集的能力，以及(iii)通過微結(jié)構(gòu)光纖錐度的非平面表面來設(shè)計(jì)任意收集體積的能力。

下面，我們量化了錐形光纖的三維(3D)光采集區(qū)域，發(fā)現(xiàn)錐形光纖在大區(qū)域(如小鼠的大腦皮質(zhì)和紋狀體)均勻地收集熒光。當(dāng)與大面積光傳輸相結(jié)合時(shí)22,24，這導(dǎo)致在有源光學(xué)表面相似的照明功率密度下，錐形光纖比扁平切割光纖的信號(hào)采集更高。這是因?yàn)榇竺娣e的錐形光纖可以提供更多的總照明功率，即更多的光子，同時(shí)將電池暴露在中等的功率密度下。我們的研究表明，通過利用選擇性光傳遞和收集，轉(zhuǎn)錄因子能夠在自由運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物中對(duì)功能性熒光信號(hào)進(jìn)行多點(diǎn)探測(cè)，包括沿著纖維錐度動(dòng)態(tài)記錄來自多個(gè)腦區(qū)的信號(hào)。我們通過在自由運(yùn)動(dòng)的小鼠中使用單個(gè)錐形光纖完成獎(jiǎng)勵(lì)收集任務(wù)，快速掃描興奮光并同時(shí)監(jiān)測(cè)背側(cè)和腹側(cè)紋狀體的多巴胺瞬變，證明了這種實(shí)驗(yàn)的可行性。

zui后，我們將控制光沿錐度傳播的模態(tài)效應(yīng)與金屬涂層錐形光纖表面的微觀和納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合，從而設(shè)計(jì)了收集體積25,26。我們將收集體積限制在錐度表面的一個(gè)角部分，這樣，光學(xué)窗口位于沿著錐形光纖界面的特定深度，只有很少的細(xì)胞體。這種方法與光學(xué)窗口的選擇性光傳輸相結(jié)合，提供了具有高度空間選擇性的深度細(xì)胞體積的雙向接口。

結(jié)果

錐形光纖的光收集特性

圖1 |錐形光纖的光收集。a，腦組織中扁平切割光纖（FF）和錐形光纖(TF)的光采集示意圖。實(shí)驗(yàn)收集概況旁邊的纖維。b，對(duì)錐形光纖的光采集場(chǎng)成像的光學(xué)設(shè)置。在pbs -熒光素滴中，一個(gè)圍繞錐形光纖的雙光子激發(fā)點(diǎn)被掃描。產(chǎn)生的熒光可通過未脫膜的PMT(顯微鏡PMT)和補(bǔ)片光纖遠(yuǎn)端的光纖PMT檢測(cè)。Ls，透鏡系統(tǒng)；F1和F2，帶通熒光濾波器；L2,鏡頭。c，在PBS-熒光素溶液中，隨著NAs的增加錐形光纖的典型ξT(x,y)集合字段(每個(gè)字段歸一化到其zui大值);比例尺，500µm。d，比較在pbs -熒光素溶液中掃描的雙光子熒光光斑采集的光子數(shù)(像素停留時(shí)間，3.2µs)，內(nèi)嵌扁平切割光纖與NA = 0.66， ψ = ~4°的錐形光纖；FF圖中的等值線顯示錐形光纖收集到的zui大光子數(shù)。比例尺，500µm。e, NA-0.66 錐形光纖在pbs -熒光素溶液中的光子收集的等距線(頂部色條，每個(gè)像素的光子數(shù);停留時(shí)間，3.2µs)；等值線在10、20、50和100光子處繪制。比例尺，500µm。f，上，遠(yuǎn)場(chǎng)成像系統(tǒng)示意圖。L1、L2、L3，成像鏡；BPF，帶通濾波器;NBF，近紅外阻斷濾波器；sCOMS，科學(xué)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體。底部，纖維輸出小關(guān)節(jié)的遠(yuǎn)場(chǎng)圖像顯示，當(dāng)光源沿著錐形光纖移動(dòng)時(shí)，直徑增加的環(huán)。比例尺，0.3 2π/λ。g, 錐形光纖在距離錐尖d處采集的點(diǎn)狀光源熒光的橫向矢量分量kt。a-d的實(shí)驗(yàn)重復(fù)了至少10次，得到了相似的結(jié)果。

我們?cè)跍?zhǔn)透明的熒光溶液中表征了錐形光纖的光聚集特性(圖1)。我們?cè)诮蒎F形的pbs熒光素(30µM)液滴中實(shí)現(xiàn)了一個(gè)雙光子掃描系統(tǒng)，以產(chǎn)生局限的熒光斑，就像各向同性的點(diǎn)狀源一樣(圖1b)。光柵掃描錐度周圍光斑時(shí)產(chǎn)生的熒光由與掃描頭同步的兩個(gè)光電倍增管(PMT)收集:(i)顯微鏡PMT，放置在標(biāo)準(zhǔn)的非脫封，外熒光路徑，和(ii)光纖PMT，置于連接的光纖貼片的遠(yuǎn)端至錐形光纖20、21(圖1b)。用顯微鏡PMT得到的參考圖像對(duì)視場(chǎng)中雙光子激發(fā)效率的輕微不均勻性進(jìn)行校正后，來自光纖PMT的信號(hào)報(bào)告了錐形光纖的熒光光采集場(chǎng)，定義為ξT(x,y)。測(cè)量了不同數(shù)值孔徑(NAs)和芯徑，但錐度角(ψ)近似為~4°的光纖的集合場(chǎng)ξT(x,y)(圖1c)。我們發(fā)現(xiàn)沿錐度的光敏區(qū)域，即收集長(zhǎng)度L，隨著光纖NA的增大和ψ的減小而增大(補(bǔ)充圖1a)。因此，錐形光纖的采集長(zhǎng)度是可以定制的通過修改光纖NA和錐度角ψ，從幾百微米提高到約2 mm。這一發(fā)現(xiàn)揭示了錐形光纖和扁平切割光纖的收集特性的重要差異，因?yàn)閷?duì)于扁平切割，收集深度基本上不依賴于NA21。

我們比較了錐形光纖和扁平切割的采集字段，NA分別為0.66(圖1d)和0.39(補(bǔ)充圖1b)。錐形光纖的光學(xué)主動(dòng)表面沿波導(dǎo)軸線延伸，導(dǎo)致沿錐度方向相對(duì)均勻的收集。從集合字段ξF(x,y)中可以看出，扁平切割光纖在端面附近采集到較高的信號(hào)強(qiáng)度。相反，錐形光纖的收集效率曲線在錐度面附近達(dá)到一個(gè)較低的zui大值，并遵循在jian 端增寬的兩葉形狀(圖1e和補(bǔ)充圖1c、d和2)如圖ξ(x,y,z)區(qū)域所示(補(bǔ)充圖1d)，被采集信號(hào)圍繞錐度軸對(duì)稱。

這是因?yàn)殄F形光纖表面通過增加波導(dǎo)直徑27的橫向傳播分量kt的模態(tài)子集與周圍環(huán)境進(jìn)行光學(xué)界面。因此，由光纖的直部分所支持的全部傳播模式逐漸沿錐形填充，導(dǎo)致錐形光纖軸的均勻收集。相反，扁平切割光纖的所有傳播模式都在纖維面耦合。

為了更好地表征錐度采集光的物理特性，我們從靠近錐度表面的點(diǎn)樣點(diǎn)對(duì)熒光進(jìn)行雙光子激發(fā)時(shí)，對(duì)所采集光的遠(yuǎn)場(chǎng)進(jìn)行成像(圖1f)。我們發(fā)現(xiàn)不同的模態(tài)子集在特定的錐度直徑下被填充(圖1f,g)，因?yàn)橄鄼C(jī)上的圖像是一個(gè)環(huán)，它的半徑隨著熒光源和錐度jian 端之間的距離的函數(shù)而增加。環(huán)半徑h是直接測(cè)量與進(jìn)入纖維的導(dǎo)模相關(guān)的波矢量的橫向分量kt 27,28。因此，光線從錐體的不同截面進(jìn)入，受到不同的引導(dǎo)模式子集的引導(dǎo)，在相機(jī)上產(chǎn)生不同直徑的環(huán)，從而建立了h與熒光信號(hào)沿錐體的位置之間的相關(guān)性。

圖2 |可重構(gòu)的錐形光纖光收集。a，與熒光素均勻染色腦片皮質(zhì)接觸的0.66 NA 扁平切割光纖的光采集場(chǎng)ξ(x,y)(左)和光度效率場(chǎng)ρ(x,y)(右)。b，與a一樣，將0.66-NA 錐形光纖插入經(jīng)熒光素均勻染色的腦切片中。c，使用全NA照明和藍(lán)色激光刺激并收集大大腦區(qū)域熒光的系統(tǒng)示意圖。收集的光在貼片光纖中反向傳播，并通過一個(gè)二色鏡將其導(dǎo)向PMT與藍(lán)光區(qū)分開來。L1和L2，晶狀體；BPF，帶通濾波器；Fluo，熒光信號(hào)；Exc，激發(fā)光。d，定點(diǎn)照明將采樣體積限制在錐形光纖的子區(qū)域。左，集光域ξT(x,y)；中心，在光纖jian 端選擇性照明得到的光度效率場(chǎng)ρT(x,y)；右，ρT(x,y)視場(chǎng)是在較寬錐度直徑下選擇性照明獲得的。e，提出的多站點(diǎn)光度測(cè)量系統(tǒng)的原理圖，該系統(tǒng)使用時(shí)分復(fù)用配置的PMT探測(cè)器。藍(lán)色激光束以增加的輸入角(θ1， θ2)射入光纖貼片線。低角度注入時(shí)，激光在錐尖處耦合，產(chǎn)生熒光信號(hào)F1；相反，當(dāng)在θ2處注入時(shí)，激光在較大錐度直徑下耦合，產(chǎn)生熒光信號(hào)F2。熒光由PMT檢測(cè)，其輸出信號(hào)與光注入刺激同步。該熒光信號(hào)根據(jù)其時(shí)間戳歸屬于相應(yīng)的區(qū)域。a、b、d實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果相似。

在大而深的區(qū)域統(tǒng)一收集

為了證明在存在散射和吸收的情況下，錐形光纖可以在大的和深部腦區(qū)獲得均勻的采集，我們測(cè)量了均勻熒光染色的腦片上扁平切割光纖和錐形光纖的熒光采集場(chǎng)ξ(x,y)和熒光激發(fā)場(chǎng)β(x,y)。結(jié)合這些場(chǎng)得到了光度測(cè)量效率場(chǎng)ρ(x,y)，它描述了熒光信號(hào)對(duì)激發(fā)光強(qiáng)度的依賴性20,21，從而給出了采樣組織體積的詳盡幾何信息。我們比較了匹配NA和內(nèi)核大小的扁平切割光纖和錐形光纖的采集和光度視野。如圖2a所示，插入到皮層表面的扁平切割光纖域ξF(x,y)和域ρF(x,y)，扁平切割光纖有效地與皮層的淺層連接;然而，他們只提取了距離透鏡面300 μm以外的信息。相反，錐形光纖的界面更均勻，錐體的光學(xué)活性區(qū)域周圍有腦組織(圖2b)。利用ξ(x,y)的對(duì)稱性，我們計(jì)算了由波導(dǎo)采樣的體積作為采集信號(hào)的函數(shù)(補(bǔ)充圖3)，并確定了產(chǎn)生給定比例的總采集信號(hào)的組織體積。我們發(fā)現(xiàn)錐形光纖的體積比扁平切割光纖大(補(bǔ)充圖4)。這一特性可以在使用全錐度表面來激發(fā)和收集信號(hào)的實(shí)驗(yàn)中加以利用(圖2c)。

沿錐度可重新配置多站點(diǎn)收集

使用位點(diǎn)選擇性光傳輸和模分解復(fù)用策略，錐形光纖的收集量可以沿著錐度在多個(gè)位置之間動(dòng)態(tài)切換22,27,28。為了定義可尋址的體積幾何配置，我們獲得了一個(gè)插入到熒光素染色腦片上的0.66-NA 錐形光纖的ξT(x,y)集合域(圖2d)。使用基于振鏡的快速掃描系統(tǒng)(圖2e)，我們通過增加kt激發(fā)模態(tài)子集將激光注入錐形光纖，從而將照明體積限制在可通過改變光輸入角度22、27、28沿錐度部分逐漸移動(dòng)的有限區(qū)域(補(bǔ)充圖5a、b)。由于熒光只在有限的被照射組織中產(chǎn)生(補(bǔ)充圖5a、b)，錐形光纖可以動(dòng)態(tài)地檢查一個(gè)功能區(qū)的多個(gè)位點(diǎn)。作為原理證明，我們結(jié)合ξT(x,y)和β(x,y)，測(cè)量了由選址照明產(chǎn)生的光度測(cè)量效率場(chǎng)ρT(x,y)。ρT(x,y)在可從光線注入角度推斷的有限區(qū)域內(nèi)zui大(圖2d)。利用這一特性，熒光信號(hào)可以歸因于使用時(shí)分復(fù)用被照亮的大腦區(qū)域(圖2e)。這是通過增加輸入角(θ1， θ2)將激光發(fā)射到光纖補(bǔ)片線來激發(fā)沿錐度在限制位置耦合的不同模態(tài)子集來實(shí)現(xiàn)的。每個(gè)照明位置產(chǎn)生的熒光(分別為F1、F2)由錐度采集，在光纖補(bǔ)片線中反向傳播，由二色鏡識(shí)別，zui后由PMT檢測(cè)，PMT輸出信號(hào)與光注入刺激同步(圖2e)。

為了證明這種方法對(duì)可能由動(dòng)物運(yùn)動(dòng)引起的模態(tài)混合有彈性22，我們?cè)趐bs -熒光素浴中進(jìn)行深度分辨光度測(cè)量時(shí)，在手動(dòng)搖動(dòng)光纖貼片的同時(shí)監(jiān)測(cè)了遠(yuǎn)場(chǎng)模式。記錄到的強(qiáng)度波動(dòng)<1%，遠(yuǎn)場(chǎng)環(huán)直徑和厚度變化<0.8%(對(duì)于未受擾動(dòng)的纖維;補(bǔ)充圖5c、d和補(bǔ)充視頻1、2)。

圖3 |基因染色的神經(jīng)群增強(qiáng)的光度測(cè)定。a，皮質(zhì)表面0.39-NA 扁平切割光纖的光采集;從左到右:雙光子表觀熒光(2p-epi)圖像，ξ(x,y)場(chǎng)，ρ(x,y)場(chǎng)，軸上采集輪廓ρ(x,y)。b, a為NA = 0.39 扁平切割光纖，接近L5。c, a,b表示一個(gè)在大腦皮層插入的0.39 NA的錐形光纖。比例尺(a?c)， 250µm。d，三種實(shí)驗(yàn)配置的光度測(cè)量系統(tǒng)示意圖:一個(gè)錐形光纖插入整個(gè)皮質(zhì)，一個(gè)扁平切割光纖插入L2/3，一個(gè)扁平切割光纖插入至L5。e, Thy1-ChR2-EYFP小鼠腦片的熒光信號(hào)強(qiáng)度(n = 10)，在大腦皮層插入0.39 NA 錐形光纖(ψ = 4°)(藍(lán)色)，在L2/3插入0.39- NA 扁平切割光纖(橙色)，在L5插入0.39- NA 扁平切割光纖(紫色)來刺激和檢測(cè)熒光。調(diào)整激光功率以獲得相似的光活性區(qū)域的功率密度(0.1 mW mm-2)。陰影區(qū)域表示平均值上的標(biāo)準(zhǔn)誤差?；揖€連接在同一實(shí)驗(yàn)中從同一腦片獲得的數(shù)據(jù)。采用雙側(cè)Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性α = 0.001。f, 錐形光纖插入固定腦片紋狀體的亮視野圖像(Thy1-ChR2-EYFP小鼠)。g, f. h中錐形光纖的光采集域ξT(x,y)，將ξT(x,y)域與位點(diǎn)選擇性傳遞光相結(jié)合，產(chǎn)生可重構(gòu)的紋狀體子區(qū)域多位點(diǎn)光采集效率域ρT(x,y)。比例尺(f?h)， 250µm。在a-c、g、h重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果相似。

增強(qiáng)熒光法在基因染色的神經(jīng)群體

對(duì)于錐形光纖，我們使用了0.39-NA 錐形光纖 (ψ = ~4°)和扁平切割光纖來刺激和檢測(cè)Thy1-ChR2-eYFP小鼠固定腦片不同皮質(zhì)層的熒光，其中EYFP僅限于L2/3和L5(圖3a-c)。我們測(cè)量了三種實(shí)驗(yàn)配置的ξ(x,y)、β(x,y)和ρ(x,y)場(chǎng):靠近淺層的FF(圖3a)、插入L5層的FF(圖3b)和穿過皮質(zhì)范圍的錐形光纖 (圖3c)。正如預(yù)期的那樣，錐形光纖刺激并收集了L2/3和L5層的熒光，而扁平切割光纖在靠近關(guān)節(jié)突的一個(gè)有限區(qū)域內(nèi)募集信號(hào)，需要重新定位以處理這兩個(gè)區(qū)域。此外，光纖纖維鈍的幾何輪廓阻礙了光纖的插入，因?yàn)楫?dāng)光纖穿過切片時(shí)，移位的組織仍然在關(guān)節(jié)突的前面。

我們比較了三種實(shí)驗(yàn)配置產(chǎn)生的絕對(duì)信號(hào)水平(圖3d)，通過調(diào)制激光功率來補(bǔ)償錐形光纖的較大光學(xué)活性區(qū)域，并在每個(gè)光學(xué)表面提供相同的平均功率密度(~0.1 mW mm-2)。在這些條件下，錐形光纖在兩個(gè)深度都相對(duì)于扁平切割光纖產(chǎn)生了更大的熒光信號(hào)(圖3e)，這可以解釋為在光收集和光傳輸中分模解復(fù)用的綜合作用。在保持中等功率密度的情況下，模式分復(fù)用將較高的總照明功率分布在較寬的表面22,27。隨著更多的光子被釋放到組織中，更多的神經(jīng)元參與到收集信號(hào)中，更多的熒光被產(chǎn)生和檢測(cè)到，這與之前的研究結(jié)果一致，在較低的輸出功率下錐形光纖比扁平切割光纖更能引起光遺傳激活22。重要的是，由于光漂白依賴于每個(gè)熒光團(tuán)的光暴露，當(dāng)全部的光活性區(qū)域被吸收時(shí)，錐形光纖在更大體積的組織上的光分布允許產(chǎn)生更多的熒光而不增加光漂白。

圖4 |體內(nèi)多點(diǎn)光度法揭示了多巴胺對(duì)背側(cè)紋狀體和腹側(cè)紋狀體運(yùn)動(dòng)和獎(jiǎng)勵(lì)的不同反應(yīng)。a，頂部，用于活體光纖光度測(cè)定的手術(shù)部位和兩個(gè)部位錐形光纖照明示意圖。下面是行為室的示意圖。紅色區(qū)域表示鼠標(biāo)需要進(jìn)入盒子的區(qū)域來觸發(fā)容器(藍(lán)色)中的食物顆粒的遞送。在獎(jiǎng)勵(lì)交付后，至少需要30秒的時(shí)間才能交付另一個(gè)獎(jiǎng)勵(lì)。b，來自一只老鼠的光度信號(hào)示例。上面，行為時(shí)間戳是通過紅外光束在容器中測(cè)出的。青色，獎(jiǎng)賞的容器入口;洋紅色，沒有獎(jiǎng)勵(lì)的容器入口。中間，動(dòng)物的中心速度。底部，dLight光度信號(hào)。紅色，來自背部的信號(hào);藍(lán)色，腹側(cè)信號(hào)。c，來自示例小鼠的所有試驗(yàn)的dLight光度信號(hào)的熱圖(兩個(gè)階段)。上方，來自背部的信號(hào)。底部，來自腹側(cè)的信號(hào)。每一行代表一個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)。N = 37次獎(jiǎng)勵(lì)容器進(jìn)入試驗(yàn)。N = 435例無獎(jiǎng)勵(lì)進(jìn)入容器的試驗(yàn)。N = 52次運(yùn)動(dòng)啟動(dòng)試驗(yàn)。d，小鼠所有會(huì)話的平均速度和dLight光度信號(hào)。來自背部的信號(hào)顯示為紅色;來自腹側(cè)的信號(hào)顯示為藍(lán)色(n = 8次，來自4只小鼠)。陰影區(qū)域代表會(huì)話平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

體內(nèi)空間分辨光度法

為了更深入地了解構(gòu)成運(yùn)動(dòng)行為和獎(jiǎng)賞驅(qū)動(dòng)行為基礎(chǔ)的神經(jīng)過程，光纖光度法已被用于探測(cè)紋狀體神經(jīng)元的活動(dòng)11-13,29。在這種情況下，錐形光纖通過使用一個(gè)遠(yuǎn)程控制的植入物對(duì)多個(gè)區(qū)域進(jìn)行采樣來擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?。為了支持這一論點(diǎn)，我們用紋狀體中的錐形光纖對(duì)位點(diǎn)選擇性熒光法進(jìn)行了表征(圖3f)。我們將一個(gè)0.66-NA 錐形光纖插入Thy1-ChR2- EYFP小鼠固定腦片的紋狀體中，在獲得ξ(x,y)場(chǎng)(圖3g)后，我們使用位點(diǎn)選擇性照明來產(chǎn)生增加輸入角度時(shí)的光度測(cè)量效率ρ(x,y)場(chǎng)(補(bǔ)充圖5)。正如預(yù)期的那樣，隨著光輸入角度的增加，響應(yīng)位點(diǎn)選擇性照明的體積逐漸遠(yuǎn)離錐形光纖jian 端(圖3h)。

我們使用dLight1.1(參考文獻(xiàn)30)同時(shí)測(cè)量背側(cè)紋狀體和腹側(cè)紋狀體的多巴胺瞬變，在體內(nèi)測(cè)試錐形光纖系統(tǒng)，這兩個(gè)腦區(qū)顯示出不同的多巴胺信號(hào)31。我們?cè)谝粋€(gè)簡(jiǎn)單的操作性條件反射范式中訓(xùn)練小鼠，在此期間我們從背側(cè)和腹側(cè)紋狀體收集dLight熒光(圖4a, NA = 0.39)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，老鼠必須待在房間的一邊，才能觸發(fā)食物獎(jiǎng)勵(lì)從位于房間另一邊的容器中傳遞出來。這迫使老鼠從房間的一邊跑到另一邊去收集獎(jiǎng)勵(lì)，并在消耗容器中的獎(jiǎng)勵(lì)時(shí)停止移動(dòng)。

我們?cè)诟箓?cè)紋狀體中觀察到經(jīng)典的獎(jiǎng)賞驅(qū)動(dòng)的多巴胺瞬變，其中dLight熒光在獎(jiǎng)賞受體進(jìn)入期間增加，在無獎(jiǎng)賞進(jìn)入期間減少(圖4b-d;補(bǔ)充圖6所示的所有試驗(yàn)均為單獨(dú)的小鼠)。然而，對(duì)于獎(jiǎng)賞和未獎(jiǎng)賞的受體條目，背側(cè)dLight熒光均下降，這表明背側(cè)紋狀體中的多巴胺釋放與運(yùn)動(dòng)變化的相關(guān)性更強(qiáng)，而不是與獎(jiǎng)賞的獲得(圖4b-d)。此外，在獎(jiǎng)賞受體進(jìn)入時(shí)，背側(cè)紋狀體和腹側(cè)紋狀體由行為引起的多巴胺變化的跡象相反，并且與多巴胺在運(yùn)動(dòng)啟動(dòng)中的功能一致32,33，兩個(gè)部位的信號(hào)在運(yùn)動(dòng)啟動(dòng)期間增加(圖4b-d)。因此，雖然背側(cè)紋狀體和腹側(cè)紋狀體多巴胺瞬變均追蹤運(yùn)動(dòng)，但只有腹側(cè)紋狀體的多巴胺瞬變對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)有強(qiáng)烈反應(yīng)。

帶有微結(jié)構(gòu)錐形光纖的設(shè)計(jì)集光體積

錐形光纖與環(huán)境界面的大表面允許根據(jù)感興趣的區(qū)域設(shè)計(jì)收集量(圖5)。這可以通過使用微納米制造技術(shù)來構(gòu)建光纖的錐度來實(shí)現(xiàn)，正如在光傳輸中所顯示的那樣25,26,34。在這里，我們展示了:(i)光收集在波導(dǎo)周圍特定角度范圍內(nèi)的限制(圖5a-d)， (ii)當(dāng)光收集被限制在沿錐度的特定點(diǎn)時(shí)，在深層皮質(zhì)層中對(duì)細(xì)胞體的觀察(圖5e-l)， (iii)選擇性照明和從兩個(gè)光學(xué)窗口收集，通過操縱激發(fā)激光束分別解決(圖5m,n)。

為了限制光的收集到波導(dǎo)表面的一半，我們對(duì)其對(duì)面的高反射鋁層進(jìn)行熱蒸發(fā)(圖5a)。半包被的TF在光學(xué)表面的ξ(x,y)(圖5b)和剖面(圖5c)與未包被的雙探針在形狀和收集到的光子數(shù)方面相似。因此，金屬涂層并沒有實(shí)質(zhì)性地改變檢測(cè)到的信號(hào)，這表明幾乎所有進(jìn)入未涂層錐度的光子都經(jīng)歷了介電全內(nèi)反射，這是由半涂層光纖中的金屬層強(qiáng)迫的。我們將半包被的錐形光纖插入由Thy1啟動(dòng)子控制的表達(dá)EYFP的固定腦切片中，在組織中測(cè)試了該裝置的側(cè)采集特性(圖5c)。我們獲得了一個(gè)雙光子的表熒光圖像和ξ(x,y)場(chǎng)，并發(fā)現(xiàn)盡管在光纖周圍都產(chǎn)生了熒光，但光纖PMT只獲得了在光纖的未涂覆部分附近產(chǎn)生的熒光(圖5d)。

圖5 |用微結(jié)構(gòu)錐形光纖設(shè)計(jì)集光體積。a，左，半金屬化TF的掃描電子顯微圖(SEM)。右，在pbs -熒光素溶液中，ξ(x,y)場(chǎng)對(duì)半涂覆的0.39-NA TF。b， ξ(x,y)場(chǎng)在pbs -熒光素溶液中。等值線分別用白色、黃色和紅色表示每像素5、10和20個(gè)光子(停留時(shí)間3.2µs)。c， ξ(x,y)對(duì)于半涂覆錐形光纖(紅色)和未涂覆錐形光纖(藍(lán)色)的場(chǎng)分布。d，在固定的腦切片中收集半涂層TF (Thy1-ChR2-EYFP小鼠)。從左到右:雙光子表熒光，ξ(x,y)場(chǎng)，合并表熒光(品紅)和ξ(x,y)(青色)。比例尺(a-d)， 250µm。e，設(shè)置用于表征從光學(xué)窗口的光收集。插圖，正方形窗的SEM顯微圖(W = ~45µm, L = ~ 1250µm)。f，與L和W相比，由采集等值面包圍的pbs -熒光素溶液的采集量分別為zui大采集量的10%、20%、40%、60%、80%(補(bǔ)充圖6)。g，固定腦片(Thy1-ChR2-EYFP小鼠)的方形窗光采集(W = ~45µm, L = ~750µm);該圖像顯示了ξ(x,y)域(青色)與同時(shí)獲得的雙光子表觀熒光圖像(品紅)的疊加;比例尺，500µm。插入，放大窗口;比例尺，50µm。h，在光學(xué)窗口上方隨高度增加的Z-stack(0、20、40、60µm)。錐形光纖配置文件和窗口位置用白色表示。比例尺，10µm。i，與g一樣，當(dāng)TF的時(shí)間窗W = ~20µm時(shí)，L = ~230µm;比例尺，100µm(插圖，10µm)。l，如h，對(duì)于W = ~20µm的光學(xué)窗口:高度為0、15、30、50µm的z-stack;比例尺，10µm。m，設(shè)置用于選擇地點(diǎn)的照明和收集。錐形光纖被淹沒在pbs -熒光素滴中。激光束脈沖(10 Hz, 50 ms, 473 nm)在受控θ下注入(補(bǔ)充圖7c)。比例尺，500µm。n，從W1和W2窗口測(cè)量的熒光信號(hào)，通過操縱θ獨(dú)立激活(熒光信號(hào)通過減去自身熒光校正)。c、d、g-l、n實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果相似。

從任意深度的光學(xué)窗口收集光

我們探索了在全鋁涂層的TF上制造光學(xué)窗來進(jìn)一步限制收集體積的可能性，我們使用聚焦離子束研磨來選擇性地去除錐形特定區(qū)域的金屬25,26。為了優(yōu)化該裝置，我們?nèi)缟纤鰧?duì)PBS-熒光素溶液(30µM)中光學(xué)窗口的光收集進(jìn)行了表征。我們制作了不同邊長(zhǎng)(W = 60、30、15µm)的光學(xué)窗平方的探針(NA = 0.39)，放置在距離光纖jian 端不同距離(L = 230、750、1,250µm)處(圖5e、f)。這些設(shè)備的體積收集圖(補(bǔ)充圖7a)顯示，較大的窗口導(dǎo)致較大的收集量(圖5f)。然而，盡管靠近jian 端的窗口從略大的體積中收集，但在較大的錐形截面上的窗口具有相似的收集特性(圖5f)。

我們?cè)赥hy1-ChR2-EYFP小鼠的固定腦片上，通過采集ξ(x,y)場(chǎng)與同步外熒光成像相關(guān)聯(lián)，測(cè)試了微結(jié)構(gòu)錐形光纖的光學(xué)性能。我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于窗寬W = ~45µm，位于距錐尖L = ~750µm的錐形光纖，光集合與光學(xué)窗口位置共定位，其集合葉不垂直于纖維軸，而是指向錐尖(圖5g)。這一特性與來自光學(xué)窗的選擇性光傳遞密切相關(guān)25，因?yàn)樗试S在深度上與細(xì)胞體積進(jìn)行界面，具有高空間選擇性(圖5h)。此外，從光學(xué)窗口附近的區(qū)域獲得的三維熒光堆棧(側(cè)W = ~45µm, L = ~750µm)(圖5h和補(bǔ)充圖7b)顯示了光度圖和表觀熒光成像的精確匹配。我們使用窗口寬度W = ~25µm的錐形光纖得到了類似的結(jié)果，錐形光纖位于距jian 端L = ~230µm處(圖5i, L)。

正如我們所展示的，對(duì)于未涂覆的錐形光纖，可以利用分模解復(fù)用策略選擇性地激發(fā)和收集來自同一錐形光纖不同截面的兩個(gè)光學(xué)窗口的熒光(圖5m和補(bǔ)充圖7c)。為此，我們將微結(jié)構(gòu)錐形光纖浸入熒光素滴中，并在不同的輸入角度注入473 nm的激光束，以每次選擇一個(gè)窗口(補(bǔ)充圖7c)。我們用聲光調(diào)制器(10 Hz, 50%占空比方波)調(diào)制激光功率時(shí)，用光電探測(cè)器測(cè)量采集到的熒光信號(hào)(圖5n)。熒光在每個(gè)窗口位置被選擇性激發(fā)，表明錐形光纖可以選擇性地照亮和收集來自兩個(gè)受限區(qū)域的光(圖5m,n和補(bǔ)充圖7c)。

圖6 |利用遠(yuǎn)場(chǎng)成像進(jìn)行深度分辨光纖測(cè)光的檢測(cè)方案。a、遠(yuǎn)場(chǎng)檢測(cè)熒光支持時(shí)分復(fù)用，提高深度選擇性。b，通過全NA刺激實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)場(chǎng)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)基于反向傳播熒光的kT值的純分模解復(fù)用。Fluo，熒光信號(hào);Exc，激發(fā)光。

討論

在神經(jīng)科學(xué)中，從大腦中表達(dá)的活動(dòng)指示器獲取熒光信號(hào)是一項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)35,36，可植入式波導(dǎo)系統(tǒng)將極大地造福神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，該系統(tǒng)可配置為有效和選擇性地收集感興趣區(qū)域的光。此外，本文中提出的方法可以在使用遠(yuǎn)場(chǎng)檢測(cè)來獲得光纖光度實(shí)驗(yàn)中的深度選擇性方面打開進(jìn)一步的視角(圖6)。

我們?cè)O(shè)想應(yīng)用錐形光纖探針從散射組織中收集熒光，將有助于解剖腦深部多個(gè)功能區(qū)的貢獻(xiàn)，同時(shí)為現(xiàn)有的光學(xué)方法提供一個(gè)通用的補(bǔ)充?；阱F形光纖的分模解復(fù)用的光度測(cè)定方法也可以潛在地?cái)U(kuò)展到大類別的軟的、生物的、活組織，其中大腦代表了散射特性方面具挑戰(zhàn)性的情況之一，考慮到散射長(zhǎng)度和各向異性。在這個(gè)框架中，錐形光纖為現(xiàn)有的光收集設(shè)備增加了有益的功能，使用了扁平切割光纖或µLED/光電探測(cè)器系統(tǒng)無法實(shí)現(xiàn)的不同配置10。

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